基于質粒的電穿孔在永生化 T 淋巴細胞中進行高效基因工程

突出

第一次全面表征永生化 T 細胞系 CTLL-2 和 HT-2。

質粒電穿孔可實現高效且具有成本效益的 T 細胞工程。

用于 T 細胞電穿孔的優化轉基因啟動子和質粒結構。

多功能轉基因遞送策略簡化了 T 細胞工程工作流程。

用于精確 T 細胞工程的高效 CRISPR/Cas9 基因組編輯工具包。

摘要

轉基因 T 細胞療法最近的臨床成功凸顯了加速 T 淋巴細胞基礎研究和功能篩選方法的迫切需要。然而，一種簡單且具有成本效益的 T 細胞高效基因工程方法仍然難以捉摸。目前的方法通常依賴于病毒轉導，這是勞動密集型的，需要嚴格的生物安全措施。基于質粒的電穿孔提供了一種經濟實惠的替代方案，但在 T 細胞中仍未得到充分探索。此外，原型 T 細胞系的可用性是有限的。在這里，我們通過關注兩種永生化小鼠 T 細胞系 HT-2 和 CTLL-2 來應對這些挑戰，它們概括了原代 T 細胞的關鍵特征，包括細胞毒性和細胞因子依賴性增殖。除了廣泛使用的 Jurkat T 細胞系外，HT-2 和 CTLL-2 還通過在基于比色皿的系統中通過優化的電穿孔成功高效地轉染了單個或多個基因。值得注意的是，質粒構建體的優化能夠遞送高達 6.5 kb 對的目標基因 （GOI） 大貨物，以及通過睡美人轉座子系統將 GOI 穩定整合到基因組中。我們還開發了在永生化 T 淋巴細胞中進行 CRISPR/Cas9 介導的基因編輯的先進方法，實現了高達 97% 的敲除效率和高達 70% 的基于同源定向修復 （HDR） 的靶向敲入效率。我們相信這種基于質粒的優化電穿孔方法將有助于淋巴細胞生物學基礎研究的進步，并為 T 細胞療法的臨床前研究提供實用、經濟高效的工具。

原標題：Plasmid-based electroporation for efficient genetic engineering in immortalized T lymphocytes  通訊作者：Martin Fussenegger

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